Родилась в богатой немецко-еврейской семье, детство провела в Европе (Вена, Париж), росла в Калифорнии. В Кембридже слушала лекции по психологии Уильяма Джемса, потом училась медицине в Университете Джонса-Хопкинса (Балтимор), курса не закончила.

В 1902 году приехала с братом в Париж, где и провела всю оставшуюся жизнь.Её квартира на улице Флёрюс (6 округ) стала одним из центров художественной и литературной жизни Парижа до Первой мировой войны и позднее. Гертруде принадлежит авторство термина «потерянное поколение» (использованного Э. Хемингуэем в качестве эпиграфа к своему роману «И восходит солнце»), которым она называла эмигрировавших за границу американских писателей, часто собиравшихся у неё в салоне на улице Флёрюс 27. Термин впоследствии послужил определением для целой группы писателей послевоенного времени, выразивших в своих произведениях разочарование в современной цивилизации, пессимизм и утрату прежних идеалов (сам Э. Хемингуэй, а также Дж. Дос Пассос, Томас Элиот, Ф. С. Фицджеральд и др.). Стайн коллекционировала и пропагандировала новейшее искусство (прежде всего, кубизм), собирала работы Пикассо (известен его портрет Стайн, 1906), Брака, Шагала, Модильяни, Гриса, Паскина, поддерживала художников Парижской школы. Она была в дружеских отношениях и многие годы переписывалась с Матиссом, Джойсом, Пикассо, Максом Жакобом, Хемингуэем, Паундом, Фицджеральдом, Уайлдером. В 1907 Стайн познакомилась с Алисой Токлас, которая стала её пожизненной спутницей. С ней они скрывались в деревенском доме в годы Второй мировой войны.

Гертруда Стайн изображена на известном полотне Павла Челищева «Феномены». Она фигурирует в игровом фильме Алана Рудольфа «Модернисты», в романе Уолтера Саттертуэйта «Маскарад» (в рус. пер. — «Клоунада»). На тексты Стайн писали музыку американские композиторы Вирджил Томпсон и Джеймс Тинни (1970), немецкий композитор Ирис тер Шипхорст, музыкальную драму «To Be Sung» по «лирической опере» Стайн написал французский композитор Паскаль Дюсапен.Писательница, как и её мать, умерла от рака. Похоронена на кладбище Пер-Лашез. Памятник писательнице поставлен в Брайант-парке в Нью-Йорке.

Несколько афоризмов от Гертруды Стайн: Свободная женщина - это та, которая позволяет себе секс до свадьбы и работу после свадьбы. Все так опасно, что можно ничего особенно не опасаться. Среди евреев было лишь три оригинальных личности:Христос, Спиноза и я Забавно, что большинство мужчин гордятся двумя вещами, которые любой мужчина может делать в точности так же: напиваться и зачинать сыновей.